背景与目的：
肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，也是世界范围内发病率及死亡率最高、治疗效果相对较差的癌症。全球每年肺癌发病率超过110万，而我国是一个肺癌大国，在过去30年里，每年都有近80万人死于肺癌，肺癌死亡率上升了465％。由于城市工业化等现代化进程的加快，生存环境的破坏、污染加剧，同时吸烟危害的滞后性，又加上我国人口增长和老龄化进程的加剧等等因素的影响，肺癌发病率和死亡率仍将继续保持快速上升的趋势。世界卫生组织预计：到2025年，恶性肿瘤死亡之首的肺癌将成为我国居民常见疾病之一，并且每年将有100万人死于此，可见肺癌对我国人民健康造成了重大影响。早发现早治疗是降低肺癌死亡率的最好措施，然而肺癌早期患者常无症状，仅为一般呼吸系统疾病所共有的症状，由于症状不典型、没有特异性，常使多数患者被误诊和延误治疗。同时肺癌临床表现复杂，诊断后的患者大部分已失去手术机会，发病率与死亡率几乎相等。鉴于以上缘故，人们对肺癌发病机制的研究显得由为重要。肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，绝大多数肺癌起源于支气管上皮细胞，对于肺细胞模型的研究绝大多数亦用人支气管上皮细胞。
苯并(a)芘[Benzo(a)pyrene，B(a)P]是已发现的200多种多环芳烃(Polycyclic aromatic hydorcarbrns，PAHs)中最主要的食品和环境污染物，性质稳定而且污染广泛,污染量大,且具有致突变、致畸变和致癌变毒性。它在熏制、烘烤和煎炸食品、煤焦油、各类碳黑和煤、石油等燃烧产生的烟气、香烟烟雾、汽车尾气中产生，以及焦化、炼油、沥青、塑料等工业污水中广泛存在的主要毒素和致癌物。地面水中的苯并(a)芘除了工业排污外，主要来自洗刷大气的雨水。B(a)P是前致癌物，本身不具致癌性，进入机体后，一部分被肝、肺细胞微粒体中混合功能的氧化酶激活而转化为数十种代谢产物，特别是转化成7，8-环氧化物时经人体代谢产生7,8-二氢二羟基-9,10-环氧化苯并(a)芘，便是最终致癌物。后者可与DNA共价键结合，造成DNA损伤不能修复或修而不复时细胞就可能发生癌变。
随着人类大规模基因组测序的完成发现，具有编码蛋白质功能的基因大约占全部基因序列的1.5%，其余许多非编码调控序列转录成非编码RNA，意味着非编码RNA在有机体中占有重要的位置。非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）据其长度分为两大类：短片段非编码RNA(如siRNA、miRNA等)和长片段非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)，其中lncRNA占ncRNA的80%。LncRNA是一类转录本长度在200-100000 nt之间的 RNA分子，不编码蛋白质，在一级结构水平上具有低保守性，但许多lncRNA都具有保守的二级结构，剪切形式以及亚细胞定位，这种保守性和特异性表明它们是具有一定的功能。
随着人们对lncRNA在细胞生物学和分子生物学中的不断地研究，lncRNA与疾病的关系受到越来越多的关注。在人类众多疾病中，恶性肿瘤作为人类死亡的头号杀手，IncRNA与肿瘤的关系倍受关注。通过全基因组测序发现，lncRNA中特定的保守元件在人类肿瘤细胞中存在着广泛表达。这类超保守元件一方面与正常细胞的原癌基因有关，起着抑制细胞生长的作用，当其异常表达则会导致细胞发生恶性转化。例如研究得比较清楚的IncRNA（MEG3）在正常脑的组织中呈现高表达，然而在脑癌中不表达，MEG3这样异常表达导致了脑组织发生癌变，这同时提示MEG3具有抑制细胞生长的潜力。另一方面lncRNA中特定的保守元件起着抑制细胞凋亡的作用，如肝癌高表达转录本HULC和H19在正常肝细胞中含量极低，肝癌发生时表达明显上升。这些现象表明lncRNA在肿瘤的发生、发展中起着重要的作用。
为了更好的探索 lncRNA在环境致癌中的作用，本研究首先用已知的环境致癌物 B(a)P诱导的人支气管上皮细胞（BEAS-2B），通过体外和体内实验方法验证B(a)P诱导的细胞是否发生恶性转变。实验结果表明B(a)P诱导第45代细胞在软琼脂上有集落形成，将此细胞注射到裸鼠皮下时形成肿瘤，病理切片分析此瘤为中分化肺腺癌。同时在B(a)P诱导BEAS-2B细胞转化过程中探讨lncRNA-DQ786227在化学致癌中的可能作用机制，结果发现lncRNA-DQ786227在B(a)P诱导BEAS-2B细胞转化过程中表达是动态变化的，随着诱导时间的延长，lncRNA-DQ786227的表达越来越高，到细胞发生恶性转化时表达最高。用此恶性转化的细胞（ BEAS-2B-T）进行研究发现， lncRNA-DQ786227异常表达，它可促进恶变细胞的增殖和增加细胞恶性程度，减少细胞的凋亡。我们由此推测长片段非编码RNA可能在B(a)P诱导的恶性转化人支气管上皮细胞中发挥重要作用，这些将增加我们对lncRNA在环境致癌中机制的理解。
方法：
1.细胞毒性实验在96孔板每孔接种1X104个细胞，隔天用4、20、100、500、1000nM浓度的B(a)P染毒24小时后，用CCK-8法检测B(a)P对BEAS-2B细胞的毒性效应。
2.细胞转化试验在6CM皿中接种1X106个细胞，选择B(a)P100nM诱导处于对数生长期的BEAS-2B细胞，同设DMSO（0.09%）溶剂对照组，染毒时间24小时后用PBS洗3次，然后常规传代培养。细胞生长汇合度达80-90%就传代，每隔3-4天染毒1次，共染毒9次，观察细胞恶性转化的形态和生长特征，细胞代数从染毒传代开始计算。
3.软琼脂培养实验在6孔板上每孔先铺好含2ml的0.6%底层琼脂，再在每孔各加2ml含第15、30、45代转化细胞混合液（1000个cell/孔)的0.3%低熔点琼脂糖于上层，每种细胞3个平行样，常规培养15-21天后，克隆计数（>50个细胞）。
4.动物致瘤性实验根据锚着独立性生长实验结果，选 BEAS-2B、B(a)P诱导第45代细胞及其DMSO对照、共计3组做裸鼠致瘤实验。将上述各组细胞接种培养后，用PBS洗涤两遍后再用胰酶消化的细胞制成细胞悬液，4-6周龄的BALB/c裸鼠前腿左内侧皮下注射BEAS-2B细胞，裸鼠腹股沟左右内侧皮下分别注射B(a)P诱导的第45代细胞对照及其相应DMSO细胞，每种细胞各200μl约含1×106个细胞的细胞悬液。每天观察其成瘤情况，成瘤后每7天测量肿瘤体积35天后处死，取出肿瘤称重。
5.肿瘤组织病理学观察将肿瘤组织块投入4%多聚甲醛固定后使用梯度酒精脱水，二甲苯中透明，浸蜡包埋后用HE染色以增加组织细胞结构各部分的色彩差异来进行病理鉴定，显微镜观察拍照。
6. LncRNA-DQ786227在细胞转化过程中表达水平的检测用 SYBR Green染料法以B(a)P诱导BEAS-2B转化的第15、30和45代细胞为模板对lncRNA-DQ786227的表达水平进行qRT-PCR定量检测。
7. siRNA干扰lncRNA-DQ786227用Lipofectamine-2000将lncRNA-DQ786227的四条siRNA引物按说明书的转染步骤导入BEAS-2B-T细胞，siRNA浓度为50nmol/L。用qRT-PCR定量检测在24h、48h和72h下的不同siRNA引物的敲除效果，确定其有效序列。
8. siRNA干扰后细胞增殖实验 BEAS-2B-T细胞以每孔3×103个接种于96孔板，隔天转染步骤7中最佳的siRNA。用CCK-8试剂按试剂盒说明书分别对转染后24h、48h和72h的细胞检测其增殖能力。
9. siRNA干扰后细胞周期实验 BEAS-2B-T细胞以每孔5×104个接种于6孔板并用无抗生素的培养基培养，隔天转染步骤7中最佳的siRNA，转染48h后收集细胞进行检测，PI染色后于流式细胞仪中检测细胞周期。
10. siRNA干扰后细胞凋亡实验按步骤9培养好细胞，siRNA转染48h后，先用0.25%不含EDTA的胰酶消化液收集细胞，然后按试剂盒说明书用Annexin V-FITC进行处理细胞，再用流式细胞仪检测细胞的凋亡率。
11.软琼脂实验用1.2%低熔点琼脂糖和等体积的2X RPMI1640混匀，在6孔板上以每孔2ml先铺好含0.6%底层琼脂，再以每孔含细胞混合液（1000个cell/孔)与等体积的2X RPMI1640的0.6%低熔点琼脂糖加于上层，常规培养15-21天后，克隆计数（>50个细胞）。
12.统计分析采用统计软件SPSS16.0对所有数据进行统计分析，每个试验数据至少重复3次，SPSS16.0分析后各实验组数据均以平均数±标准差（MEAN±SD）来表示。两组数据间的比较用双侧 t检验，而三组或三组以上数据间的比较采用单因素方差分析，P﹤0.05为差异有统计学意义。
结果：
1．形态学观察在光镜下观察到，BEAS-2B细胞正常状态下以长梭形、纺锤形细胞为主，圆形和类圆形细胞比例很少，细胞瘦长，面积较小，胞浆较少，且细胞单层生长，走行方向较为一致，无复层生长，细胞群体呈现有序或放射状排列，有明显的生长接触抑制。转化细胞多为圆形与类圆形，面积较大，个体大形态丰满，胞浆丰富，边缘呈膜状向外扩展，核异形，多核仁，核浆比例增高，且细胞呈复层生长，排列紊乱，无生长接触抵制。
2．软琼脂培养 B(a)P诱导第15代BEAS-2B细胞实验组在软琼脂上形成小的细胞集落，十几个左右细胞聚集成团，但生长缓慢，并且不能进一步形成较大的克隆，达不到每个集落大于50个细胞的标准；至第45代时，实验组细胞能在软琼脂上形成克隆，生长快且能形成每个大于50个细胞的集落。
3．动物致瘤性实验将B(a)P诱导第45代BEAS-2B细胞皮下注射到裸鼠腹股沟都能成瘤，每隔7天测量一次肿瘤体积并每个时间段的绘制生长曲线，随着生长时间的延长体积越来越大,取出肿瘤组织后用4%甲醛固定。
4．组织病理学观察常用 HE染色以增加组织细胞结构各部分的色彩差异来进行病理鉴定。苏木精(Hematoxylin，H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色。伊红(Eosin，E)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色。染色结果表明，注射此瘤细胞的裸鼠均长出了中期分化的肺腺癌细胞。
5. LncRNA-DQ786227在细胞转化过程中的表达情况 LncRNA-DQ786227在B(a)P诱导BEAS-2B细胞转化过程中表达逐渐升高。细胞代数从B(a)P诱导细胞开始计数，第30代转化细胞与相应的对照组细胞相比升高(1.82±0.15)倍，而第45代转化细胞升高（5.25±0.35）倍，均显著高于各自相应的对照组细胞（P<0.05）。
6.用siRNA敲除lncRNA-DQ786227后的表达变化 BEAS-2B-T细胞分别用4个siRNA序列转染处理24h、48h和72h后，其中转染处理48h后各siRNA干扰的效果最好，此时干扰引物siRNA1、siRNA2、siRNA3和siRNA4的敲除效率分别是59.3%，31.3%，22.0%和17.9%，siRNA1干扰组与其对应的 siRNA NC组相比差别有统计学意义（P<0.05）。其中干扰引物siRNA1效果最好，可用于后面所有的实验。
7. siRNA干扰后细胞增殖能力改变 BEAS-2B-T细胞用siRNA1转染48h后，通过流式细胞仪分析siRNA1组细胞活力为（18.93±1.45）%，与其对应的siRNA NC组及NT组相比差别具有统计学意义（P<0.05）。
8. siRNA干扰后细胞周期改变 BEAS-2B-T细胞用siRNA1转染48h后，通过流式细胞仪分析siRNA1组的细胞周期与其对应的siRNA NC组及NT组相比差别无统计学意义（P>0.05）。
9. siRNA干扰后细胞凋亡率改变 BEAS-2B-T细胞用siRNA1转染48h后，通过流式细胞仪分析 siRNA1组的凋亡率升高为（13.12±2.41）%，与其对应的 siRNA NC组及NT组相比差别有统计学意义（P<0.05）。
10.软琼脂实验 BEAS-2B-T细胞用siRNA1转染48h后，siRNA1组集落形成率降低，降低到（5.67±1.16）‰，siRNA1组与其对应的siRNA NC组及NT组及相比差别具有统计学意义（P<0.05）。
结论：
1．建立了B(a)P诱导的人支气管上皮BEAS-2B细胞的恶性转化模型。
2．在B(a)P诱导的BEAS-2B恶性转化过程中lncRNA-DQ786227的表达异常。
3．LncRNA-DQ786227在B(a)P诱导恶变的BEAS-2B-T细胞表型中具有重要作用，可促进恶变细胞增殖和增加细胞恶性程度，减少细胞的凋亡。
- 作 者：
- 高丽云
- 学科专业：
- 内科学
- 授予学位：
- 博士
- 学位授予单位：
- 广州医科大学
- 导师姓名：
- 蒋义国
- 学位年度：
- 2013
- 研究方向：
- 语 种：
- chi
- 基金项目：
